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常規育種
奶牛DNA親子鑒定檢測技術

奶牛DNA親子鑒定檢測技術

  • 親子鑒定概念

利用分子遺傳學、生物學及醫學的理論和技術,分析子代與親代之間的相似程度,來判斷親代與子代之間是否具有血緣關系。

  • 親子鑒定原理

利用常染色體微衛星分型技術,選取不同染色體上的微衛星位點,采用多重PCR技術擴增微衛星標記,檢測微衛星位點的遺傳多態性,分型得出各位點等位基因的大小,通過軟件統計分析,確定或排除親子關系。

  • 奶牛DNA親子鑒定技術檢測方法
    • 樣本采集:靜脈采集血樣3~5 mL,ACD抗凝,-20℃保存。對公牛,亦可采集2~3劑細管精液,液氮保存。
    • DNA提?。河梅?氯仿抽提法從奶??鼓脱龎K中提取基因組DNA。用高鹽法從公牛精液中提取基因組DNA。
    • 引物序列:參考聯合國糧農組織(FAO)和國際動物遺傳學會(ISAG)的推薦的CSRM60、BM1824、ETH10、SPS115、BM2113、ILSTS006、ETH225、TGLA227、TGLA122、BM1818、TGLA53、INRA023 12個微衛星標記引物。
    • 多重PCR擴增:產物擴增分4次PCR反應完成。同一擴增組合的引物加入同一PCR反應管中。25 µL反應體系:10×Buffer 2.5 µL、50 mmol/L MgCl2 1.2 µL、10 mmol/L dNTP 0.6 µL、Taq DNA聚合酶2 U、10 µmol/L引物(擴增組合)各1.0µL、待測個體模板DNA 100 ng、加雙蒸水至反應總體積為25 µL。PCR擴增條件:94℃預變性5 min;94℃變性30 s,57~60.5℃退火30 s,72℃延伸30 s,35個循環;72℃延伸5 min,4℃保存。
    • PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測:配置1%的瓊脂糖凝膠,將待檢PCR產物5 µL和上樣緩沖液以5:1的比例混合均勻,加入點樣孔。5 µL 500bp DNA Marker作參照。恒壓100 V,電泳40 min。電泳結束后在凝膠成像系統上觀察和拍照,分析結果。
    • 微衛星DNA多態性分析:PCR產物、去離子甲酰胺和FAM/HEX/TAMRA內標按 0.5 µL: l0 µL: 0.5 µL比例混合,95℃變性5 min,ABI PRISM 3100儀器測序,ABI PRISM 3100 DATA COLLECTION軟件分析微衛星的基因型。
    • 微衛星標記分型:利用ABI3100儀器對微衛星標記進行基因分型。檢測個體的12個微衛星標記的基因分型結果,根據相對熒光強度和片段大小,獲得待測個體不同STR標記的基因型。不同親緣關系的個體,其微衛星標記的等位基因大小不同,表現出不同的基因型。
    • 親子關系判定:根據待檢個體STR標記的基因型,利用Cervux30軟件分別計算其親子指數(Parternity index)的LOD值(對數值)。當LOD>0時,候選親本有可能是真實的親代,LOD值最高的個體是最相似的親本個體;當LOD<0時,候選親本不可能是真實的親本。

 

?    微衛星標記分型

 

 

 

 

 

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